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    細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)全步驟解析

    發(fā)布時(shí)間: 2022-06-08  點(diǎn)擊次數(shù): 2867次


    實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備:


    細(xì)胞,可拍照的顯微鏡,Transwell小室,孔徑8μm,沒(méi)包被膠的Transwell,遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買(mǎi)的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,BSA,正常的*培養(yǎng)基,無(wú)菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結(jié)晶紫染液(0.1%PBS結(jié)晶紫)


    Transwell操作步驟


    01

    用BD公司的Matrigel 1:8或者根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來(lái)決定稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。


    02

    制備細(xì)胞懸液前可先用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%的血清培養(yǎng)細(xì)胞,讓細(xì)胞饑餓12-24h,進(jìn)一步去除血清的影響。


    03

    消化細(xì)胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸及調(diào)整密度,通常調(diào)整細(xì)胞密度至5×10^5cells/ml。


    04

    取細(xì)胞懸液100μl加入Transwell上室, 也可以根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度進(jìn)行調(diào)整,操作小提示:接種劑量不同的細(xì)胞,其侵襲能力是不同的,細(xì)胞量過(guò)多,穿過(guò)膜的細(xì)胞會(huì)過(guò)多過(guò)快,最后會(huì)難以統(tǒng)計(jì)結(jié)果;而細(xì)胞量過(guò)少,可能還沒(méi)到檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn),所有的細(xì)胞都已穿過(guò),進(jìn)入下室。因此最少也要保證在收樣的時(shí)候,上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。


    05

    24孔板下室一般加入600μl含生長(zhǎng)因子或血清的*培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就會(huì)減弱甚至消失,種板時(shí)一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起去除完氣泡,再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。若是平行孔,一般設(shè)置兩組.


    06

    培養(yǎng)細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依細(xì)胞侵襲能力而定)。24h較常見(jiàn),時(shí)間節(jié)點(diǎn)的設(shè)置除了要考慮到細(xì)胞的侵襲力外,處理因素以及細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。




    統(tǒng)計(jì)結(jié)果步驟:


    01

    采用直接計(jì)數(shù)法,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無(wú)鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當(dāng)風(fēng)干。


    02

     0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,注意不要蹭到已穿膜的那一層細(xì)胞,之后再用PBS洗3遍。


    03

    400倍顯微鏡下每個(gè)樣本取6-10個(gè)視野觀察細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均值,統(tǒng)計(jì)分析。


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