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    斑馬魚胚胎細(xì)胞的培養(yǎng)

    發(fā)布時間: 2023-01-05  點(diǎn)擊次數(shù): 1193次

    原理

    收集胚胎,除去絨毛膜,用胰蛋白酶分散胚胎細(xì)胞,然后在胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)從斑馬魚囊胚和原腸期胚獲得的原代細(xì)胞。

    材料與儀器

    鏈酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA 胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層 人重組白血病抑制因子
    LDF基礎(chǔ)培養(yǎng)液 LDF原代培養(yǎng)液 LDF維持培養(yǎng)液 D培養(yǎng)液 Holtfreter緩沖液 稀漂白劑

    步驟

    鱒魚胚胎提取物:

    (a)收集胚胎(受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系,在 10°C 條件下飼養(yǎng),或者受精后 3 天的斑馬魚,在 28°C 條件下飼養(yǎng)),在 -80°C 條件下凍存

    (b)為了制備提取物,將約 150 g 胚胎融化后,采用 Tissuemizer 勻漿器(Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min

    (c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜,然后在 4°C 條件下離心(20000 g,30 min )

    (d)離心后收集上清液,留下表面的亮橘色脂層

    (e)將上清液移入 1 只新離心管,按操作步驟(c ) 離心

    (f)收集上清液,留下剩余的脂質(zhì),然后在 4°C 條件下超速離心(100000 g,60 min )

    (g)超速離心后收集上清液,留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液,然后過濾除菌

    (h)提取物過一系列濾器(1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾

    (i)將提取物按 0.5 ml 分裝后,在 -80°C 條件下凍存

    (j)為了用提取物培養(yǎng)細(xì)胞,測量蛋白質(zhì)濃度(見方案 21.4 ),然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度

    (k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏,最長 2 個月

    BRL 細(xì)胞條件培養(yǎng)液:

    (a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中,用 DMEM/F12/10FB 培養(yǎng)液培養(yǎng) BRL 細(xì)胞(ATCC )

    (b)當(dāng)細(xì)胞匯合時,用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養(yǎng)液,在 37°C 條件下培養(yǎng)

    (c)5 天后吸出 LDF,過濾,在 -20°C 凍存

    (d)向細(xì)胞中加入新鮮的 LDF,5 天后重復(fù)此過程。條件化的 LDF 培養(yǎng)液可從同一個培養(yǎng)瓶中收集 3 次。然后,將細(xì)胞分開培養(yǎng),使細(xì)胞再次匯合

    1. 在中襄胚或早原腸胚期收集胚胎,用清潔水浸洗數(shù)次。

    2. 浸洗后將胚胎移入 60 mm 皮氏皿 ( 50~100 個/皿)。然后,將皮氏皿放入層流通風(fēng)櫥中,在無菌條件下放置。

    3. 將胚胎放入稀漂白劑中浸泡 2 min,然后用無菌的 Holtfreter 緩沖液浸洗數(shù)次。

    4. 用 2 ml 鏈酶蛋白酶 E 溶液孵育 10 min,使胚胎去絨毛膜。然后,將胚胎在皮氏皿中輕輕攪動,使胚胎與部分消化的絨毛膜分離。

    5. 將培養(yǎng)皿傾斜,以便從一側(cè)收集胚胎,用巴斯德吸管輕輕吸出 1.5 ml 鏈酶蛋白酶溶液。為了防止去絨毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂,保持皮氏皿傾斜,以便胚胎懸浮在剩余的鏈酶蛋白酶溶液中。

    6. 加入 2 ml Holtfreter 緩沖液,輕輕攪動,以便輕輕浸洗胚胎。

    7. 將皮氏皿傾斜,吸去大部分 Holtfreter 緩沖液,將胚胎懸浮在約 0.5 ml 緩沖液中。

    8. 重復(fù)浸洗步驟兩次以上。

    9. 在最后 1 次浸洗后,將胚胎懸浮在 0.5 ml Holtfreter 緩沖液中,然后加入 2 ml 胰蛋白酶溶液。

    10. 用胰蛋白酶將胚胎孵育 1 min,然后通過用吸管輕輕吹打 3~4 次分離細(xì)胞。

    11. 將細(xì)胞懸液立即移入無菌的聚丙烯離心管中,然后加入 200 μl FBS,以終止胰蛋白酶的消化作用。

    12. 通過離心(500 g, 5 min ) 收集細(xì)胞,然后用無 FBS 或鱒魚血清的 LDF 原代培養(yǎng)液混懸細(xì)胞。

    13. 將細(xì)胞以 1×104 個/cm2 的細(xì)胞密度種植到含有生長抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的多孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。

    14. 在加入 FBS 或鱒魚血清前讓細(xì)胞附著于飼養(yǎng)層(約 15 min )。在培養(yǎng)液中使用 10 ng/ml 人重組 LIF,此優(yōu)于 BRL 條件培養(yǎng)液 [Sun et al.,1995a,1995b ]。


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