1） 來源：女性 大腸

2） 形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長(貼壁弱，消化時間短，時間過長會導(dǎo)致細胞不長)

3） 含量：>1x10^6 細胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用。

CCD841 CON人正常結(jié)腸上皮細胞（STR鑒定）運輸和保存

干冰運輸及復(fù)蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完-全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完-全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，特級胎牛血清10 %  P/S 1%

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。換液頻率：隔天換液。

3） 凍存液：90%FBS，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：

1.細胞經(jīng)過運輸后，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰撞-死亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，1000rpm(約150g)離心3-5min，棄上清。加5ml PBS重懸細胞，再1000rpm(約150g)離心3-5min，用新鮮的完-全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)瓶。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

2.細胞生長不均時，可以將細胞消化吹散后加入新的培養(yǎng)基重新接種或傳代。

細胞生長緩慢時，可以選擇更換優(yōu)質(zhì)胎牛血清或者提高血清濃度（最高不超過20%）培養(yǎng)，也可以根據(jù)細胞生長狀態(tài)，選擇傳代細胞到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

二． 細胞處理：

1） 凍存細胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完-全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完-全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完-全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，具體以細胞消化到相互分離但未脫落，輕敲幾下可以下來為準，嚴禁消化到細胞完-全漂浮，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。 

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完-全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。